Perkembangan Penelitian Kultur Jaringan (In Vitro) pada Tanaman Industri, Pangan, dan Hortikultura
Usaha di bidang pertanian yang semakin berkembang menyebabkan kebutuhan akan bibit semakin meningkat. Untuk memenuhi kebutuhan bibit yang sangat banyak dengan waktu yang relatif cepat sangat sulit dan lama jika melalui prbanyakan secara konvensional. Dengan demikian, teknologi kultur jaringan telah terbukti dapat digunakan sebagai teknologi pilihan yang sangat menjanjikan untuk pemenuhan kebutuhan bibit tanaman.
Kultur jaringan merupakan salah satu aplikasi dari perkembangan bioteknologi. Kultur jaringan tanaman merupakan teknik menumbuh kembangkan bagian tanaman, baik berupa sel, jaringan atau organ dalam kondisi aseptik secara in vitro. Teknik kultur jaringan dicirikan dengan kondisi yang aseptik atau steril dari segala macam bentuk kontaminan, menggunakan media kultur yang memiliki kandungan nutrisi yang lengkap dan menggunakan ZPT (zat pengatur tumbuh), serta kondisi ruang tempat pelaksanaan kultur jaringan diatur suhu dan pencahayaannya (Yusnita, 2003).
Teknologi kultur jaringan ini memiliki faktor tertentu yang harus diantisipasi, yaitu penyimpangan genetik yang dapat mungkin terjadi. Untuk itu, perlu dimengerti mekanisme fisiologi apa yang terjadi, faktor apa saja yang menyebabkannya sehingga mutasi dapat dihindarkan. Banyak hal yang harus dipelajari dan dikuasai seperti mekanisme fisiologi, daya aktivitas, laju transportasi, sifat persistensi, daya aktivitas dari berbagai komponen organik dan anorganik penyusun media tumbuh serta faktor lain yang berpengaruh terhadap keberhasilan kultur in vitro.
ISI
Perbanyakan Tanaman Melalui Kultur Jaringan
Teknik kultur jaringan memanfaatkan prinsip perbanyakan tumbuhan secara vegetatif. Berbeda dari teknik perbanyakan tumbuhan secara konvensional, teknik kultur jaringan dilakukan dalam kondisi aseptik di dalam botol kultur dengan medium dan kondisi tertentu. Karena itu teknik ini sering kali disebut kultur in vitro. Dikatakan in vitro (Bahasa Latin), berarti “di dalam kaca” karena jaringan tersebut dibiakkan di dalam botol kultur dengan medium dan kondisi tertentu (Hameed, 2006).
Metode kultur jaringan dikembangkan untuk membantu memperbanyak tanaman, khususnya untuk tanaman yang sulit dikembangbiakkan secara generatif. Bibit yang dihasilkan dari kultur jaringan mempunyai beberapa keunggulan, antara lain: mempunyai sifat yang identik dengan induknya, dapat diperbanyak dalam jumlah yang besar sehingga tidak terlalu membutuhkan tempat yang luas, mampu menghasilkan bibit dengan jumlah besar dalam waktu yang singkat, kesehatan dan mutu bibit lebih terjamin, kecepatan tumbuh bibit lebih cepat dibandingkan dengan perbanyakan konvensional (Yusnita, 2003). Teori dasar dari kultur in vitro ini adalah totipotensi. Teori ini mempercayai bahwa setiap bagian tanaman dapat berkembang biak karena seluruh bagian tanaman terdiri atas jaringan-jaringan hidup. Oleh karena itu, semua organisme baru yang berhasil ditumbuhkan akan memiliki sifat yang sama persis dengan induknya (Khan, 1988).
1. Tanaman obat langka puar (Elettaria sumatrana). Secara visual tanaman tersebut mirip jahe dan secara konvensional mudah diperbanyak. Dengan kondisi tersebut timbul anggapan bahwa tanaman tersebut mudah diperbanyak melalui kultur jaringan. Tetapi setelah dicoba, sistem regenerasinya sangat lambat dan terdapat masa-lah pelayuan yang cepat. Apabila tumbuh sedikit, tunasnya cepat mati, keadaan yang sama ditemukan pada garut (Maranta arundinacea). Masalah oksidasi fenol yang sering dijumpai pada tanaman lain tidak ditemukan pada tanaman tersebut. Diduga masalah ini terjadi karena ada metabolik sekunder yang dikeluarkan oleh jaringan tanaman dan masalah semakin meningkat dengan kondisi formulasi media yang kaya akan garam-garam mineral yang dapat menimbulkan tekanan osmosa tinggi (Lestari, 2004).
2. Perakaran jambu mente (Anacardium occidentale). Jambu mente termasuk tanaman tahunan berkayu yang sangat lambat daya regenerasinya dan kesulitan meningkat apabila tunas in vitro diakarkan. Setelah dicoba lebih dari 200 formulasi media, akar dapat diinduksi pada media dasar dengan kandungan total ion yang rendah, diberi NAA dan asam amino tertentu. Formulasi media tidak terlalu kompleks tetapi memerlukan kesabaran untuk mendapatkan yang terbaik. Formulasi media terdiri dari garam-garam makro dan mikro sebanyak 14 unsur, vitamin umumnya 5 macam, zat pengatur tumbuh sebanyak 2 macam, dan anti oksidan. Apabila salah satu unsur dihilangkan akan memberikan hasil yang berbeda, selain kondisi fisiologi pohon induk, jenis eksplan, musim pengambilan eksplan serta faktor lain juga harus diperhitungkan. Semakin banyak unsur yang terkandung dalam media tumbuh maka semakin banyak kombinasi perlakuan yang harus diberikan. Pengalaman, pengetahuan mengenai fisiologi, peranan setiap komponen organik maupun anorganik, pengaruh faktor fisik, serta daya in-tuisi yang kuat sangat diperlukan untuk keberhasilan sistem regenerasi.
3. Perbanyakan vegetatif pepaya hasil persilangan pepaya Hawai dengan pepaya Bangkok. Beberapa tahun yang lalu, penelitian perbanyakan pepaya hasil persilangan antara pepaya Hawai dan pepaya Bangkok dilakukan dengan hasil yang kurang memuaskan. Masalah yang dihadapi adalah tunas tidak dapat tumbuh memanjang, rosette, daun cepat menguning, dan akhirnya gugur. Sebanyak 86 formulasi media telah dicoba mulai dari media MS (1,½, ¼), Anderson (1, ½), DKW (1,½, ¼), WPM (1, ½) kombinasi dengan sitokinin (zeatin, 2iP, BA, kine-tin), dan GA3 pada beberapa konsentrasi, penggunaan berbagai asam amino tetapi belum memberikan hasil yang baik. Biakan cenderung melakukan proliferasi tunas walaupun tidak diberi sitokinin dan tunasnya tetap pendek, cepat mengering serta selalu membentuk kalus bagian dasarnya. Setelah dicoba penggunaan media dasar yang kaya mineral, penambahan sitokinin konsentrasi rendah, beberapa asam amino, serta anti auksin, tunas dapat memanjang dan tidak menguning
Perbaikan Tanaman Melalui Kultur In Vitro
Beberapa metode penelitian kultur jaringan telah dilakukan untuk meningkatkan keragaman genetik tanaman yaitu melalui metode keragaman somaklonal, seleksi in vitro, kultur anter, penyelamatan embrio, dan fusi protoplas (Mariska, 1998). Penelitian perbaikan tanaman melalui kultur in vitro sering dipertanyakan dan ditanggapi, sebagai penelitian yang mudah dan tidak berbobot, bahkan mulai ditinggalkan. Tetapi penelitian ini tetap dilakukan terutama pada spesies tanaman yang selalu diperbanyak secara vegetatif serta pada tanaman yang tidak berbunga. Apabila setiap regeneran baru tetap diteliti terus menerus (berkelanjutan) sampai di lapang, maka pada akhirnya akan diperoleh nomor-nomor harapan dengan sifat yang diharapkan.
1. Keragaman Somaklonal
Keragaman somaklonal didefinisikan sebagai keragaman genetik dari tanaman yang dihasilkan melalui kultur sel, baik sel somatik seperti sel daun, akar, dan batang, maupun sel gamet. Keragaman somaklonal yang terjadi dalam kultur jaringan merupakan hasil kumulatif dari mutasi genetik pada eksplan dan yang diinduksi pada kondisi in vitro. Keragaman somaklonal merupakan perubahan genetik yang bukan disebabkan oleh segregasi atau rekombinasi gen, seperti yang biasa terjadi akibat proses persilangan (Maralappanavaret al., 2000).
Keragaman somaklonal dalam kultur jaringan terjadi akibat penggunaan zat pengatur tumbuh dan tingkat konsentrasinya, lama fase pertumbuhan kalus, tipe kultur yang digunakan (sel, protoplasma, kalus jaringan), serta digunakan atau tidaknya media seleksi dalam kultur in vitro (Hameed, 2006).
Dapat dikatakan bahwa variasi somaklonal telah berhasil memperbaiki sifat produksi beberapa tanaman seperti tomat, tebu, seledri, jagung, padi, dan sorgum Tetapi juga harus dikatakan tentang ketidaksuksesan beberapa percobaan dengan pendekatan ini, misalnya pada tanaman gandum, jagung, dan barley meskipun diusahakan dengan skala yang besar dan ekstensif (Maralappanavar et al., 2000).
Panili. Keragamaan somaklonal merupakan keragaman genetik yang terjadi secara spontan hasil regenerasi sel somatik. Perubahan sifat genetik dan sel somatik telah dilaporkan sejak tahun 1961. Metode tersebut telah diterapkan pada tanaman panili kombinasi dengan mutagen fisik (radiasi sinar gamma). Pengembangan panili mengalami masalah penyakit busuk batang yang disebabkan Fusarium oxysporum. Dari beratus-ratus somaklon yang akhirnya menjadi nomor baru telah diuji di rumah kaca dan lapang (di 2 lokasi yang sudah terkontaminasi penyakit F. oxysporum). Dari percobaan lapang di Sukabumi diperoleh sekitar 12 nomor yang tidak terserang. Nomor-nomor tersebut saat ini sudah ditanam di Bali (salah satu sentra produksi panili) yang sudah tercemar penyakit, bekerjasama dengan Dinas Pertanian setempat.
Nilam. Nilam merupakan penghasil minyak atsiri yang potensial dikembangkan dan Indonesia merupakan pemasok utama di pasar dunia. Peningkatan kadar minyak nilam melalui teknik konvensional sulit dilakukan karena tanaman tersebut tidak berbunga. Peningkatan keragaman genetik dilakukan pada tunas in vitro yang telah mengalami periode kultur in vitro selama 2 tahun dan subkultur 12 kali. Kalus yang berasal dari jaringan daun yang diisolasi dari biakan tersebut kemudian dikaluskan dan dibuat suspensi sel kemudian massa selnya ditaburkan di atas kertas filter. Sel tersebut di-radiasi dengan sinar gamma 0-3 krad. Sekitar 411 somaklonal yang diperoleh diuji di 2 lokasi (Bogor dan Bandung) selama 2 tahun ber-turut-turut. Dari sekitar 411 soma-klonal diperoleh 5 somaklon yang kadar minyaknya tinggi dan di anta-ranya terdapat 1 somaklon yang kadar minyaknya mencapai 4% dan selalu stabil pada setiap panen de-ngan musim yang berbeda. Pada tahun ketiga dicoba kembali di Bogor, kadar minyaknya tetap stabil, demikian pula pada tahun keempat.
Jahe. Masalah penyakit yang disebabkan bakteri Pseudomonas solanaceae pada jahe merupakan masalah yang sulit dipecahkan. Untuk meningkatkan keragaman genetik dicoba melalui keragaman somaklonal pada kalus dan tunas adventif yang telah mengalami periode kultur in vitro yang lama. Diperoleh sekitar 4 somaklon yang tidak menunjukkan gejala sakit setelah ditanam pada lokasi yang telah tercemar penyakit (Bogor) dan satu somaklon KJ 40 tumbuhnya lebih tegar dibandingkan dengan somaklon lainnya.
2. Seleksi In Vitro
Penggunaan metode seleksi in vitro pada perbaikan tanaman telah banyak digunakan untuk meningkatkan sifat ketahanan baik terhadap faktor biotik maupun abiotik. Seleksi in vitro lebih efesien dan hasilnya dapat dipertanggung jawabkan, karena melalui seleksi in vitro jutaan sel dapat diseleksi dengan hanya menggunakan beberapa botol kultur atau petridis, sedangkan seleksi di lapang harus menggunakan beratus – ratus tanaman yang diuji pada areal yang lebih luas, selain itu seleksi in vitro tidak terlalu dipengaruhi oleh lingkungan serta memungkinkan melakukan seleksi pada tingkat sel (Biswas et al., 2002).
Teknik in vitro melalui variasi somaklonal dan perlakuan mutasi fisik seperti iradiasi sinar gamma pada jaringan atau sekelompok sel (kalus) merupakan alternatif untuk mendapatkan varian yang diinginkan. Melalui seleksi in vitro varian tersebut dapat diseleksi untuk mendapatkan varian tanaman yang toleran terhadap kekeringan (Sutjahjo, et. al., 2007).
Seleksi in vitro untuk toleransi terhadap cekaman kekeringan yang dihasilkan dari kultur in vitro dapat memberikan kesempatan untuk mengembangkan metode seleksi in vitro sehingga dapat bermanfaat dalam program pemuliaan tanaman (Mattjik, 2005).
Untuk mendapatkan varian somaklonal yang diinginkan biasanya dilakukan dengan menggunakan teknik seleksi in vitro. Dalam hal ini kondisi selektif tertentu dapat digabungkan dalam media kultur in vitro dan dipakai untuk menumbuhkan varian-varian somaklon yang telah diperoleh. Tanaman hasil regenerasi dari jaringan yang dapat mengatasi kondisi selektif tersebut, besar kemungkinannya juga akan mempunyai fenotipe toleran terhadap kondisi selektif. Hal ini sangat menguntungkan karena proses seleksi yang dilakukan in vitro akan sangat efisien mengingat tempat yang dibutuhkan relatif sedikit, kondisi selektif dapat dibuat homogen, dan efektifitas seleksi akan sangat tinggi. Menurut Barwale (1990), kombinasi antara induksi keragaman somaklonal dan seleksi in vitro merupakan salah satu kesempatan yang menawarkan kemudahan dalam menghasilkan individu dengan karakter yang spesifik.
Metode seleksi in vitro sangat cocok digunakan untuk mendapatkan tanaman yang toleran terhadap kekeringan, karena dapat dilakukan penapisan atau penyaringan pada sekelompok populasi (sekelompok sel) pada kondisi yang seragam pada lingkungan yang terbatas. Dalam hal ini, ada 3 hal penting yang perlu diperhatikan dalam seleksi in vitro. Pertama, sistem regenerasi pada sel atau kalus yang resisten hasil seleksi. Kedua, kemampuan sel/kalus untuk memelihara integritas genetik ketahanan pada material yang diseleksi. Ketiga, perubahan genetik pada proses seleksi tidak hanya sekedar adaptasi fisiologis saja (Chopra et al., 1989). Salah satu metode untuk seleksi cekaman kekeringan secara in vitro yang digunakan adalah penggunaan senyawa osmotic stress seperti polyethylen glycol (PEG).
Tersedianya agen selektif untuk simulasi kekeringan yaitu PEG serta tersedianya sistem regenerasi kalus dan tunas menjadi planlet, memungkinkan seleksi in vitro dapat dilakukan untuk mendapatkan tanaman jeruk resisten terhadap kekeringan. Seleksi in vitro merupakan salah satu metode dari keragaman somaklonal tetapi lebih efektif dan efisien karena perubahan genetik lebih diarahkan pada sifat yang diinginkan. Metode seleksi in vitro diterapkan pada tanaman panili, lada, dan kedelai.
Lada. Untuk memecahkan masalah penyakit Phytopthora capsici, massa sel diinduksi dari jaringan daun dan diseleksi dengan filtrat P. capsici. Saat ini telah dihasilkan sekitar 8 somaklon yang akan diaklimatisasi di rumah kaca.
Kedelai. Pada tahap awal penelitian kedelai dicoba 10 varietas, 7 jenis eksplan, dan 18 formulasi media untuk produksi kalus embriogenik, serta 25 formulasi media untuk pendewasaan dan perkecambahan. Dari hasil kegiatan awal, dicoba kembali formulasi media, sumber eksplan, dan kondisi fisiologi pohon induk yang memberikan hasil yang baik dan ternyata metode yang diper-oleh dapat diulang dengan keberhasilan yang relatif sama. Setelah diperoleh metode regenerasi melalui jalur embriogenesis somatik yang dapat diulang, maka dicoba menyeleksi massa sel pada media dengan kemasaman rendah (sekitar 4) dengan menggunakan AIC13. 6H20 sebagai komponen seleksi. Tanaman hasil seleksi in vitro telah ditanam sampai generasi ke-6 di lahan masam Gajrug (Banten) dan Jasinga (Kabupaten Bogor). Dari generasi ke-6, telah diperoleh galur-galur baru dengan produksi polong lebih tinggi dibandingkan dengan varietas Sindoro yang telah dilepas sebagai varietas tahan lahan masam.
Panili. Seleksi pada tanaman panili dilakukan pada struktur globular ukuran (1 mm) yang diseleksi dengan asam fusarat dan filtrat F. oxysporum. Seleksi dilakukan bertahap, tunas hasil regenerasi diseleksi silang dengan komponen seleksi lainnya. Hasil sementara menunjukkan bahwa tunas hasil regenerasi struktur globular yang tidak diseleksi apabila diinokulasi menjadi mati (screening in vitro) tetapi untuk tunas hasil seleksi tetap hidup. Terdapat perbedaan morfologi yang nyata, biakan dari asam fusarat lebih tipis akarnya sedangkan biakan dari filtrat F. Oxysporum daunnya lebih hijau dan lebih tebal.
3. Kultur Anter
Pada program pemuliaan tembakau terdapat satu kegiatan, yaitu kultur anter varietas Burley. Dari hasil penelitian telah diperoleh metode regenerasi melalui jalur embriogenesis somatik dengan menggunakan media MS + 0,30 mg/l GA3 + 750 mg/l glutamin. Benih somatik yang diperoleh dan anter mempunyai penampakan yang lebih kecil dari pohon induknya.
4. Embrio Rescue (Penyelamatan Embrio)
Pemuliaan tanaman terjadi melalui hibridisasi dan seleksi. Dengan menyilangkan tanaman, pemulia berusaha untuk menggabungkan karakter terbaik dari 2 tanaman yang berbeda. Melalui seleksi, pemulia mencoba untuk menyeleksi anakan yang memiliki kombinasi kualitas yang optimal dari kedua tanaman induk. Proses ini tentu saja sangat tergantung pada produksi benih viable. Jika benih viabel tidak terbentuk, tidak akan ada keturunan yang akan diseleksi. Tidak ada anakan tidak berarti fertilisasi tidak terjadi setelah polinasi. Kemungkinan terjadi keguguran embryo pada fase dini perkembangan biji, akibat penyebab yang tidak diketahui. Dengan teknik kultur jaringan, embryo yang belum matang ini dapat diselamatkan (embrio rescue) (Smith, 2000)
Teknik penyelamatan embrio (embryo rescue) mulai dikembangkan tahun 1900-an yang memungkinkan benih yang belum matang atau embrio diselamatkan untuk membentuk tanaman baru. Ini biasanya dilakukan untuk benih – benih yang memiliki masa dormansi yang panjang. Belakangan ini juga berkembang teknik penyelamatan bakal biji yang telah terserbuki tapi tidak pernah menghasilkan benih viable. Penyelamatan embryo banyak dilakukan untuk memperoleh hibrida interspesifik dan intergenerik. Misalnya pada kentang dan berbagai tanaman hias.
5. Fusi Protoplas
Fusi protoplas adalah salah satu metode persilangan atau hibridisasi tanaman denga memanfaatkan rekayasa genetika konvensional (Maaike, 2004). Protoplas adalah sel tanaman tanpa bagian dinding sel (Cliff, 2001). Teknik fusi protoplas dapat digunakan untuk mencampur sifat genetis dari spesies tanaman yang sama ataupun dari spesies yang berbeda. Selain itu, teknik ini menguntungkan untuk diterapkan dalam persilangan tanaman steril ataupun tanaman dengan siklus hidup yang panjang. Untuk menginduksi atau mendukung terjadinya fusi protoplas dapat dilakukan dengan pemakaian senyawa kimia seperti polietilen glikol (PEG) ataupun penggunaan arus listrik untuk membantu fusi (elektrofusi) (Nejat, 1993).
Ketika dua protoplas bersatu, dapat terjadi pemisahan atau penggabungan dua inti sel (nukleus) sehingga menghasilkan tanaman dengan sifat baru hasil pencampuran kedua tetua. Apabila salah satu inti sel hilang selama terjadinya fusi maka akan dihasilkan sel baru yang disebut sitoplasmik hibrid (cybrid) (Rajiv, 2005).
Penelitian produksi bahan tanaman dan pemuliaan tanaman terung (Solanum melongena) terhadap penyakit tular tanah melalui fusi protoplas dengan dana dari Masyarakat Ekonomi Eropa telah dilakukan. Penelitian tersebut merupakan kerja sama antara peneliti Perancis, India, Italia, dan Indonesia. Masing-masing melakukan penelitian yang sama dengan spesies tanaman yang berasal dari negara-nya masingmasing. Teknik terbaru untuk isolasi dan fusi protoplas telah dicoba dan berhasil memfusikan S. melongena de-ngan S. torvum atau S. aethiopicum. Hasil fusi yang dihasilkan oleh se-mua negara yang terlibat telah ditanam di Inlitbio Pacet. Selain itu, tanaman hibrida somatik hasil fusi telah dilakukan kultur anter untuk mendapatkan tanaman dihaploid dan tanaman tersebut kemudian disilang balik dengan S. melongena dan tanaman F1-nya menunjukkan sifat ketahanan yang sama dengan S. aethiopicum dan buah menyerupai S. melongena
Penyimpanan Tanaman Obat Langka Melalui Kultur Jaringan
Dari spesies tumbuhan obat yang ada di Indonesia, sekitar 31 telah dikategorikan langka. Untuk itu, penyelamatan tumbuhan obat langka ini perlu dilakukan dan salah satunya dengan menyimpan sebagai koleksi in vitro. Sampai saat ini, tumbuhan obat langka yang telah diselamatkan disajikan pada Tabel 3. Metode yang digunakan antara lain melalui pertumbuhan minimal.
5. CONTOH GAMBAR
.jpg)

PENUTUP
Kesimpulan
1. Kultur jaringan dapat dimanfaatkan tidak hanya untuk perbanyakan tetapi juga untuk perbaikan tanaman dan penyimpanan plasma nutfah.
2. Untuk dapat merakit varietas baru, penelitian tidak hanya dilakukan di laboratorium tetapi harus dilanjutkan sampai lapang dan sangat diperlukan kerja sama dengan para pemulia konvensional.
DAFTAR PUSTAKA
Barwale, U.B dan J.M. Widholm. 1990. Soybean: PlantRegeneration and Somaclonal Variation. Dalam Y.P.S. Bajaj (Ed). Biotechnology in Agricultural and Forestry. Vol 10. Legumes & Oil Seed Crop 1. Springer-Verlag Heidelberg. Berlin.
Biswas, J., B. Chowdhurry, A. Bhattacharya, and B. Mandal. 2002. In vitro screening for increases drought tolerance in rice. In Vitro Cell. Dev Biol-Plant 38:525-530.
Chopra, et.al. 1989. Selection In Vitro. Educa Book. Australia.
Hameed N, Shabbir A, Ali A, Bajwa R. 2006. In vitro micropropagation of disease free rose (Rosa indica L.). Mycopath 4:35-38.
Khan IA, Shaw JJ. 1988. Biotechnology in Agriculture. Punjab. Agric. Res. Coordination Board Faisalabad, Pakistan. pp. 2.
Lestari, E.G., I. Mariska, dan D. Seswita. 2004. Aplikasi kultur jaringan untuk perbanyakan klonal tanaman kencur. Warta Tumbuhan II(3):11-14.
Maaike Raaijmakers (Juni 2004). “Protoplast fusion and organic farming”. liff L. Hedley (2001). Carbohydrates in Grain Legume Seeds: Improving Nutritional Quality and Agronomic Characteristics. CABI. ISBN 978-0-85199-467-3.Page.156.
Maralappanavar, M. S., M. S. Kuruvinashefti dan C. C. Harti. 2000. Regeneration, establishment and evaluation of somaclones in Sorghum bicolor (L.) Moench. Euphytica115: 173-180.
Mariska, I. dan Hobir. 1998b. Peningkatan keragaman genetik tanaman melalui metode in vitro. Jurnal Penelitian dan Pengembangan Pertanian XVII(4):115-121.
Mattjik, N.A. 2005. Peranan Kultur Jaringan dalam Perbaikan Tanaman. Orasi Ilmiah Guru Besar Tetap Kultur Jaringan. Fakultas Pertanian Institut Pertanian Bogor, 24 September 2005. 102 hlm. Smith, R.H. 2000. Plant Tissue Culture: Techniques and Experiments. Academic press, London.
Nejat Düzgüneş (1993). Membrane fusion techniques. Academic Press. ISBN 978-0-12-182122-7.Page.379-388.
Rajiv Tyagi, P.R. 2005. Yadav. Biotechnology of Plant Tissue. Educa Books. ISBN 978-81-8356-073-3.Page.94-95.
Sutjahjo SH, Abdul K dan Ika M. 2007. Efektifitas polietilena glikol sebagai bahan penyeleksi kalus nilam yang diradiasi sinar gamma untuk toleransi terhadap cekaman kekeringan. Ilmu-ilmu Pertanian Indonesia. Vol. 9. No. 1, 2007. Hlm 48-57.
Yusnita, 2003. Kultur Jaringan Cara Memperbanyak Tanaman Secara Efisien. Agromedia Pustaka, Jakarta.